Abgesehen von der Pflicht der Ladung Folge zu leisten, ist der Zeuge verpflichtet vollständig und richtig auszusagen. Wer vor Gericht als Zeuge oder als Zeuge im Rahmen einer förmlichen Vernehmung durch die Kriminalpolizei falsch aussagt ist nach § 288 StGB (falsche Beweisaussage) strafbar und mit einer Freiheitsstrafe von bis zu drei Jahren zu bestrafen.
Zu Beginn der Vernehmung muss der Zeuge belehrt und ermahnt werden, richtig und vollständig auszusagen. Er ist außerdem darauf hinzuweisen, dass er eine Vertrauensperson zur Vernehmung beiziehen kann. Auch im Hinblick auf die Art der Fragestellung gibt es Einschränkungen. So sind Suggestivfragen – also Fragen, bei denen durch die Art und Weise der Fragestellung der Zeuge beeinflusst wird, eine Antwort mit einem vorbestimmten Aussageinhalt zu geben– grundsätzlich zu vermeiden und unzulässig.
In manchen Fällen besteht jedoch eine Aussagebefreiung. So sind etwa Personen, die im Verfahren gegen Angehörige aussagen sollen oder besonders schutzbedürftige Opfer, sofern sie kontradiktorisch vernommen wurden (zB Minderjährige oder Opfer von sexueller Gewalt), von der Aussage befreit. Wird auf die Aussagebefreiung nicht explizit verzichtet, ist die gesamte Aussage nichtig. Besonders schutzwürdige Opfer haben das Recht eine kontradiktorische Vernehmung zu beantragen und bekommen somit die Möglichkeit in der Hauptverhandlung nicht auszusagen. In diesem Fall darf ausnahmsweise das Protokoll dieser kontradiktorischen Vernehmung verlesen werden. Das ist deshalb eine Besonderheit, weil, abgesehen von wenigen gesetzlichen Ausnahmen, die Verlesung von Protokollen in der Hauptverhandlung nicht vorgesehen ist, sondern die Zeugen unmittelbar in der Hauptverhandlung aussagen sollen.
Weiters haben Zeugen in bestimmten Fällen das Recht ihr Aussage zu verweigern. Das betrifft zB Zeugen, die durch ihre Aussage Angehörige der Gefahr eines Strafverfahrens aussetzen würden oder sich selbst einer Straftat verdächtig machen würden. Auch bestimmte Berufsgruppen wie Rechtsanwälte oder Fachärzte für Psychiatrie sind im Rahmen ihrer Berufsausübung berechtigt, ihre Aussage zu verweigern. Sofern der Zeuge nicht rechtzeitig über sein Verweigerungsrecht informiert wurde, ist jener Teil der Aussage nichtig, auf den sich das Verweigerungsrecht bezieht.
